北理工課題組在氨基酸高產菌株的篩選策略方面取得重要進展
發布日期：2023-06-19 供稿：生命學院 攝影：生命學院
編輯：肖雯 審核：周連景 閱讀次數：
近日，北京理工大學霍毅欣教授團隊在氨基酸高產菌株的篩選策略方面取得重要進展。相關成果以“A tRNA Modification-based strategy for Identifying amiNo acid Overproducers (AMINO)”為題，在頂級期刊《Metabolic Engineering》（影響因子：8.829）上發表（doi.org/10.1016/j.ymben.2023.04.012）。該工作以北京理工大學為第一通訊單位，霍毅欣教授和馬曉焉特別副研究員為共同通訊作者，已出站博士后郭昊及王寧博士為共同第一作者。
氨基酸已被廣泛應用于食品、動物飼料、制藥和化妝品行業。到2026年，全球氨基酸市場價值預計將達到296億美元，復合年增長率(CAGR)為6-8%。微生物發酵是氨基酸生產的主要方法，占全球氨基酸產量的80%。而發酵的關鍵是獲得高性能的發酵菌株。目前，氨基酸高產菌株的選育主要依靠構建突變庫和后續篩選，突變庫的建立方法已經較為成熟，而篩選策略往往決定了是否可以獲得理想的氨基酸高產菌株。
圖1 氨基酸的生產現狀及AMINO策略的示意圖
本團隊長期從事氨基酸及其衍生物的生物合成及高產菌株篩選策略的研究，2018年，以“Utilization of rare codon-rich markers for screening amino acid overproducers”為題，在頂級期刊《Nature Communications》（影響因子：17.694）上發表（https://www.nature.com/articles/s41467-018-05830-0/）。該工作首次提出了一種基于稀有密碼子的新型氨基酸高產菌株篩選策略。這種策略使用稀有密碼子抑制標記基因的翻譯，高產目標氨基酸的菌株可以更加高效地表達富含稀有密碼子的標記基因，從而產生可被選擇的表型。這種策略適用于10種標準氨基酸和各種工業宿主的高產菌株篩選，其可操作性和普適性得到了極大的提升。
圖2 基于稀有密碼子的氨基酸高產菌株篩選策略的原理
為了進一步拓展基于翻譯過程的氨基酸高產菌株篩選策略，將其推廣至全部20種標準氨基酸甚至非蛋白質氨基酸的高產菌株篩選，本團隊此次提出了一種基于人造tRNACUA的氨基酸高產菌株篩選策略（AMINO）。
氨酰化是一種兩步多底物反應，其速率不僅取決于兩種主要底物tRNA和氨基酸的濃度，還取決于它們各自與氨酰化合酶（aaRS）的親和力。抑制這些因素中的任何一個都會破壞氨酰化過程，而促進其他因素應該可以補償這種負面影響。基于這一原理，可以根據目標氨基酸，使用與aaRS或aaRS-aa親和力降低的tRNA，篩選目標氨基酸的高產菌株。其中，改造tRNA的反密碼子是一種通用且簡便的降低其與aaRS親和力的方法。而在所有64個密碼子中，琥珀密碼子UAG通常不編碼氨基酸，將tRNA的反密碼子更改為UAG互補三聯體（CUA）提供了一種通用的解決方案，既可以降低tRNA與同源aaRS的親和力，又可以防止干擾其他氨基酸的正常翻譯。
圖3 基于人造tRNACUA的篩選策略用于標準氨基酸高產菌株的篩選
基于上述原理，本團隊提出了一種基于人造tRNACUA的氨基酸高產菌株篩選策略。作為概念驗證，通過基于生長和/或熒光激活細胞分選（FACS）的篩選，分別從大腸桿菌和谷氨酸棒狀桿菌的隨機突變庫中篩選出L-色氨酸、L-苯丙氨酸和L-天冬氨酸等五種氨基酸的高產菌株，并構建了L-半胱氨酸，L-賴氨酸，L-甘氨酸和L-谷氨酸以及兩種非蛋白質氨基酸（5-羥基色氨酸和3-甲基-組氨酸）的選擇系統。為了進一步降低篩選標記的設計難度和提高本策略的通用性，在氯霉素抗性基因 cm 的5′末端添加了一段富含UAG的Tag序列，建立了一種改進的篩選標記。這種標記基因可以適用于對所有氨基酸高產菌株的篩選，并且可以通過簡單的PCR法改變UAG的數量，來調節篩選強度的大小。隨后，還證明了該策略可以被推廣至大腸桿菌MG1655，XL10-gold，C321.?A和谷氨酸棒狀桿菌。
圖4 基于人造tRNACUA的篩選策略用于非蛋白質氨基酸高產菌株的篩選
最后，本文對篩選出的色氨酸高產菌株進行了轉錄組測序和分析，通過差異基因表達分析鑒定了 41 個參與芳香族氨基酸生物合成、糖酵解途徑 (EMP) 和磷酸戊糖途徑（PP）的基因。結果表明，通過增強 L-色氨酸生物合成途徑以及抑制競爭和降解途徑來調節輔因子和代謝流重定向有利于L-色氨酸的生產，這些分析可能有助于重構氨基酸高產菌株，突破現有菌株的生產天花板。
圖5 通用型氨基酸高產菌株篩選標記
總之，這項工作為氨基酸高產菌株的高通量篩選提供了一種通用、便捷且無毒的策略，極大地提升了氨基酸高產菌株篩選策略的可操作性，普適性和通量。僅需引入改造后的tRNA和篩選標記基因，即可實現對20種天然氨基酸、各種非蛋白質氨基酸、用于氨基酸生物合成的高效酶和生物元件以及氨基酸衍生物的高產菌株篩選。該策略背后的機制可能會為構建用于參與其他雙底物反應的底物高產菌株提供新的思路。
此外，本團隊還系統地總結了氨基酸高產菌株篩選領域的最新進展，相關成果以“Recent advances in screening amino acid overproducers”為題，在《Engineering Microbiology》期刊上發表（doi.org/10.1016/j.engmic.2022.100066），北京理工大學為第一通訊單位，博士研究生妥俊愷為第一作者。該工作全面回顧了基于營養缺陷型、基于生物傳感器和最新的基于翻譯過程的氨基酸高產菌株的篩選策略，詳細討論了這些策略的設計原則、應用范圍、工作效率、篩選精度和普適性。
圖6 常用的氨基酸高產菌株的篩選策略
該項工作得到了國家自然科學基金（Grant No. 32000059）、國家重點研發計劃（Grant No. 2019YFA0906500和2019YFA0904104）和中央高校基本科研業務費專項資金的支持，也感謝北京理工大學生物與醫學工程公共實驗中心的支持。
分享到：