北理工團隊在生物法合成天然產物糖苷類藥物領域取得重要進展
發布日期：2024-08-27 供稿：化學與化工學院 攝影：化學與化工學院
編輯：田柳 審核：王振華 閱讀次數：
三萜化合物是一類重要的植物天然產物，因其獨特的藥理活性而受到廣泛關注。然而，由于分子中的疏水碳環結構，三萜化合物普遍存在溶解度低和生物利用度差的問題。糖基修飾可顯著改善三萜化合物的水溶性，因此三萜化合物多以糖苷的形式存在。其中，直鏈三糖基修飾是一種重要的糖基修飾類型，對發揮三萜化合物獨特的藥理活性具有重要意義。相較于化學合成法，利用酶法合成三萜糖苷化合物具有反應條件溫和、定向催化和環境友好等優勢，特別是在合成具有復雜多糖基修飾的三萜糖苷化合物時，酶法可避免化學合成法中繁雜的基團保護與去保護過程。尿苷二磷酸-糖基轉移酶（uridine diphosphate glycosyltransferases，UGTs）是催化天然產物糖基修飾的主要生物催化劑，在目前已報道的UGTs中，大多僅催化三萜單糖苷和二糖苷的合成，具有直鏈三糖基修飾催化活性的UGTs數量極少，限制了三萜直鏈三糖苷的酶法合成。此外，該類型UGTs的催化功能特點和底物特異性的分子機制也不清晰。針對以上問題，本研究通過生物信息學分析、結合體外酶學性質表征系統發掘可催化合成三萜直鏈三糖苷的UGTs，并揭示該類型UGTs催化底物的結構特點，通過祖先酶序列重構、氨基酸突變和計算機模擬等手段闡明其底物特異性的分子機制。相關研究成果以“Engineering the Substrate Specificity of UDP-Glycosyltransferases for Synthesizing Triterpenoid Glycosides with a Linear Trisaccharide as Aided by Ancestral Sequence Reconstruction”為題目在國際知名期刊Angewante Chemie International Edition上發表（DOI: /10.1002/anie.202409867）。北京理工大學化學與化工學院博士研究生簡行為該論文的第一作者，清華大學李春教授與北京理工大學化學與化工學院長聘副教授馮旭東為該論文的共同通訊作者。
本研究首先對7個UGT91H亞家族酶進行系統性表征，結果表明7個UGTs對14個三萜化合物有催化活性，特異性的在其C2 '' -OH修飾一分子糖基，成功合成26個三萜直鏈三糖苷。揭示了7個UGT91H亞家族酶催化糖基受體底物的結構特點：僅可催化在C3-OH修飾二糖基且第一個糖基為葡萄糖醛酸基或葡萄糖基的三萜化合物，而對三萜苷元或三萜單糖苷則沒有催化活性。另外，7個UGTs對UDP-糖基供體具有較為嚴格的特異性，對UDP-鼠李糖（UDP-Rha）具有最高的偏好性，對UDP-木糖（UDP-Xyl）次之，而對其他UDP-糖供體則沒有催化活性。
利用祖先酶序列重構技術獲得UGT91H亞家族的祖先酶UGT91H_A1， 其在保留UGT91H亞家族現代酶直鏈三糖基修飾功能外，表現出了更廣的底物譜和更高的活性。在糖基受體方面，UGT91H_A1可催化17個三萜化合物修飾一分子糖基。在糖基供體方面，除UDP-Rha和 UDP-Xyl之外，UGT91H_A1還具有高效利用UDP-葡萄糖（UDP-Glc）的活性。最后利用UGT91H_A1成功合成了 33個三萜直鏈三糖苷。
進一步闡明了UGT91H_A1中非保守的RTAS Loop對UGT91H亞家族酶的底物特異性具有重要影響。將RTAS Loop替換至UGT91H8 和UGT91H7對應區域，分別獲得突變體UGT91H_6mu和UGT91H7M，均具有催化新底物α-常春藤苷（17）糖基修飾的活性。分子動力學模擬和量子力學計算表明，RTAS Loop通過影響酶和底物的相互作用和結合能來調控酶的底物特異性。
針對糖基供體UDP-Rha成本高的問題，構建了包括蔗糖合酶 Gu SUS1-Δ9、UDP-Rha 合酶 At RHM2和雙功能鼠李糖合酶 At NRS/ER的三酶級聯體系，實現了以廉價的蔗糖為原料合成UDP-Rha。將該體系與UGT91H_A1偶聯的四酶體系（分步法）降低了甘草次酸 3- O -GlcA-Gal-Rha（2a）和常春藤皂苷元 3- O -Ara-Rha-Rha（17a）的合成成本，底物轉化率分別達到80.1 ± 0.3%和61.3 ± 4.1%。
以上述表征的UGT91H亞家族酶的序列為探針，建立了基于進化分析的快速酶挖掘方法，對NCBI數據庫中8種豆科植物基因組進行系統分析和挖掘，共獲得23個候選酶，最終證實19個為UGT91H亞家族酶，大大提高了酶挖掘的效率和準確性。從中挑選了PNY09112.1、GAU40116.1和PNX78912.1進行功能表征，均表現出對三萜化合物C2 '' -OH特異性修飾一分子鼠李糖基或木糖基的活性。此外，GAU40116.1和PNY09112.1還對UDP-Gal具有微弱的新活性。
本研究系統探索了UGT91H亞家族酶的催化功能特點，并利用祖先酶重構技術拓展了該亞家族酶的底物譜，實現23個新型三萜直鏈三糖苷的酶法合成。鑒定了影響UGT91H_A1底物特異性的關鍵區域RTAS Loop，并通過對UGT91H亞家族酶中RTAS Loop相應區域的突變，實現了該亞家族酶底物特異性的調控。還開發了基于進化分析的UGT91H亞家族酶的快速挖掘方法。本研究為進一步拓展三萜化合物更多酶法糖基化修飾類型提供了新思路和新方法。
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